小核酸药物递送手艺开展历程

第一代：LNP+小核酸→肝脏：

将小核酸药物包裹在脂质纳米颗粒（LNP）中，，，使被包裹的小核酸药物免于降解和扫除，，，并增进其跨细胞膜运输到目的靶位。。LNP通过肝细胞外貌低密度脂卵白受体识别和摄取，，，适用于治疗肝脏相关的疾病。。

第二代：GalNAc+小核酸→肝脏：

N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）通过与寡核苷酸共价毗连，，，其内吞递送依赖肝细胞ASGPR介导的受体循环。。进入内体后的酸化情形增进受体–配体解离，，，从而释放寡核苷酸药物。。ASGPR在内体酸化后快速接纳至细胞外貌，，，可重复加入配体连系，，，从而实现高效、可重复的肝摄取。。

新一代：抗体+linker+小核酸（即AOC)：

AOC的结构与ADC相似，，，主要由三部分组成：施展组织靶向作用的载体，，，linker，，，作为payload的小核酸。。AOC将抗体和小核酸有用地连系在一起，，，以实现靶向治疗，，，可以镌汰治疗疾病所需的药物量，，，同时解决不可靶向和小核酸药物的递送问题。。与古板的小核酸疗法相比，，，AOC具有更好的药代动力学特征和更具特异性的生物漫衍。。

AOC药物偶联手艺原理

小核酸药物由于其化学结构可修饰性强，，，可通过多种要领与抗体举行偶联。。以下为制备AOC的四种常用要领：

离子相互作用（电荷相互作用）

寡核苷酸主链带负电荷，，，鱼精卵白带正电荷。。将抗体或抗体片断（Fab或scFv）与鱼精卵白构建成融合卵白，，，通过鱼精卵白的正电荷偶联带负电荷的寡核苷酸，，，形成抗体偶联寡核苷酸（antibody-oligonucleotide conjugates）。。

优点：简朴，，，无邪；；；且寡核苷酸进入细胞，，，多阳离子复合物可充当溶酶体逃逸剂。。在溶酶体中，，，多阳离子复合物充当质子海绵，，，氯离子在内部扩散以赔偿电荷不平衡，，，导致渗透膨胀，，，形成走漏膜。。这种溶酶体逃逸很主要，，，由于寡核苷酸没有强的膜通透性。。

弱点：离子相互作用是可逆的、不稳固的；；；且难以确定DAR值。。且鱼精卵白的免疫原性较高，，，容易引发不良反映。。

亲和性毗连

通过Avidin/Streptavidin?Biotin偶联：将硫醇修饰的DNA化学毗连到马来酰亚胺激活的链霉亲和素上，，，天生链霉亲和素-DNA，，，进一步与种种生物素化卵白非共价毗连。。主要应用于免疫检测要领开发。。进一步开展，，，直接使用链霉亲和素的四个生物素连系位点，，，将生物素化的抗体和生物素化的寡核苷酸直接相连。。

优点：操作历程相对浅易、条件温顺。。

弱点：难以控制DAR值，，，血浆内不稳固。。

直接毗连（直接偶联）

直接偶联是指在寡核苷酸上预先引入可反映基团，，，再与抗体的赖氨酸、半胱氨酸或工程化位点形成共价毗连，，，是最靠近ADC化学系统的AOC构建方式。。为了不影响作用机制，，，修饰通常置于siRNA的sense strand。。

优势：结构均一、化学稳固性高，，，并与既有ADC工艺系统高度兼容。。Linker体积小、反抗体影响有限，，，可连系定点偶联实现准确控制DAR，，，使纯化、剖析和放大生产更为可控。。

局限：寡核苷酸自己对化学情形敏感，，，因此对linker的设计、修饰位置以及与双链退火历程的兼容性要求更高。。直接偶联战略虽然可获得高度均质的AOC，，，但对化学修饰的精准度与序列工程提出更严酷的条件。。”

核酸双链杂交连系

先将一条单链寡核苷酸以共价方式毗连至抗体，，，再通过与其互补链的杂交形成双链结构，，，从而获得AOC。。这种要领使用了核酸自然的碱基配对特征，，，使偶联历程无需直接在抗体上构建完整双链。。

优势：对某些含有特殊结构或重大化学修饰的核酸而言，，，杂交方式往往比直接偶联更易获得更高的制备产率与更温顺的反映条件。。由于只需在单链上引入可毗连基团，，，互补链可通过杂交快速、定向地组装，，，大大镌汰了化学修饰对寡核苷酸自己构象与稳固性的影响，，，也为制备较长或结构敏感型寡核苷酸提供了更大的工艺弹性。。

局限：双链长度与序列需准确优化：过短会导致杂交不稳固、影响最终AOC均一性；；；过长则可能爆发二级结构，，，降低杂交效率。。别的，，，该要领在放大生产时对杂交条件、双链比例和体内稳固性的要求更高，，，因此在实现高均一、高稳固性的工业化工艺上仍需更细腻的设计与控制。。

AOC的优势

将抗体药物的组织特异性优势与小核酸的靶点特异性优势相连系，，，解决现在小核酸药物主要通过LNP、GalNAc递送系统靶向肝脏的问题，，，因此具备辽阔的开展空间。。

优势可概况为：1、具有靶向性，，，增添生物使用度，，，镌汰毒作用；；；2、提高稳固性，，，增添理想半衰期，，，提高有用性。。

推荐阅读：

参考文献

[1] Kalina Paunovska, et al. Drug delivery systems for RNA therapeutics. Nat Rev Genet. 2022 May;23(5):265-280. doi: 10.1038/s41576-021-00439-4.
[2]. Julien Dugal-Tessier, et al. Antibody-Oligonucleotide Conjugates: A Twist to Antibody-Drug Conjugates. J Clin Med. 2021 Feb 18;10(4):838. doi: 10.3390/jcm10040838.
[3]. Victor Lehot, et al. Non-specific interactions of antibody-oligonucleotide conjugates with living cells. Sci Rep. 2021 Mar 15;11(1):5881. doi: 10.1038/s41598-021-85352-w.
[4]. K Sreedurgalakshmi, et al. Cetuximab-siRNA Conjugate Linked Through Cationized Gelatin Knocks Down KRAS G12C Mutation in NSCLC Sensitizing the Cells Toward Gefitinib. Technol Cancer Res Treat. 2021 Jan-Dec;20:15330338211041453. doi: 10.1177/15330338211041453.
[5]. Nicole B?umer, et al. Antibody-coupled siRNA as an efficient method for in vivo mRNA knockdown. Nat Protoc. 2016 Jan;11(1):22-36. doi: 10.1038/nprot.2015.137.
[6]. Hua Lu, et al. Site-specific antibody-polymer conjugates for siRNA delivery. J Am Chem Soc. 2013 Sep 18;135(37):13885-91. doi: 10.1021/ja4059525.
[7]. Patrick J Kennedy, et al. Antibodies and associates: Partners in targeted drug delivery. Pharmacol Ther. 2017 Sep;177:129-145. doi: 10.1016/j.pharmthera.2017.03.004.
[8]. Guizhi Zhu, et al. Aptamer-Drug Conjugates. Bioconjug Chem. 2015 Nov 18;26(11):2186-97. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.5b00291.
[9]. Tsukasa Sugo, et al. Development of antibody-siRNA conjugate targeted to cardiac and skeletal muscles. J Control Release. 2016 Sep 10;237:1-13. doi: 10.1016/j.jconrel.2016.06.036
[10]. Asher Mullard. Antibody-oligonucleotide conjugates enter the clinic. Nat Rev Drug Discov. 2022 Jan;21(1):6-8. doi: 10.1038/d41573-021-00213-5.